La solution performante pour des essais immunologiques à haute spécificité : IgE anti-humaine – Jackson ImmunoResearch

Derniers arrivés dans la gamme Jackson ImmunoResearch, les anticorps monoclonaux anti-IgE humaines sont adaptés à la recherche et au développement de diagnostics. Spécifiques de la chaîne epsilon (ε), ils complètent les anticorps anti-IgG, IgM et IgA humaines existants.

Ces anticorps monoclonaux produits chez la souris (clone ME.114) sont disponibles conjugués à une gamme de molécules rapporteuses notamment la phosphatase alcaline et la biotine, ce qui permet une excellente sensibilité.

Ils conviennent à la détection des IgE humaines par diverses techniques, notamment ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), Lateral flow immunoassay (LFIA), cytométrie de flux, western blot et CLIA (Chemiluminescent immunoassay).

Spécificité

Ces anticorps spécifiques de la chaîne epsilon (ε) ont été testés par ELISA et présentent une réactivité croisée minimale avec les IgG, IgM ou IgA humaines. La figure 1 est un transfert Western qui démontre la spécificité de ces anticorps. Aucune détection d’autres classes d’immunoglobulines n’a pu être identifiée. Jackson ImmunoResearch n’a pas testé si cet anticorps pouvait détecter les immunoglobulines d’autres espèces.

Figure 1 : Western blot montrant la spécificité de l’anticorps Anti-Human IgE de Jackson ImmunoResearch pour les IgE humaines. 1 μg d’immunoglobuline humaine purifiée (IgE, IgG, IgA ou IgM comme indiqué) a été chargée dans des puits individuels. Une SDS-PAGE a été réalisée dans des conditions non réductrices et les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose. Les taches ont été bloquées avec 5 % de BSA dans du PBS/T et sondées avec de l’anti-IgE humaine peroxydase (209-032-241) à une dilution de 1:10000. Le blot a été visualisé en utilisant de l’ECL.

Figure 2 : Western blot montrant la détection de 100  ng d’IgE humaine purifiée par l’anticorps IgE humaine dans des conditions réductrices et non réductrices. Veuillez noter que cet anticorps donnera un signal plus faible lors de la détection de la protéine réduite et n’est donc pas recommandé pour les applications où la détection d’IgE réduite est requise.

Sensibilité

Ces anticorps anti-IgE humaine peuvent être utilisés pour détecter les IgE humaines provenant de diverses sources avec une excellente sensibilité. La figure 3 illustre la sensibilité de ces anti-IgE lorsqu’elles sont utilisées dans un test ELISA indirect, montrant leur capacité à détecter les IgE recouvrant les puits à deux concentrations différentes. La figure 4 montre la sensibilité de ces anticorps lorsqu’ils sont utilisés dans un ELISA indirect pour détecter les IgE purifiées à partir de différentes sources de myélome et de plasma.

Détection d’IgE purifiées à différentes concentrations d’enrobage	Détection d’IgE à partir du plasma et du myélome
Figure 3 : Détection d’IgE par ELISA indirect. Plaque recouverte de 100 μl/puit d’IgE purifiée provenant de plasma humain à 2 ou 0,2 μg/ml dans un tampon d’enrobage au carbonate pendant une nuit à 4°C. La plaque a été bloquée avec 300 μl/puit de 1 % de BSA (albumine de sérum bovin sans IgG et sans protéase 001-000-161) dans du PBS/T pendant 2 h. L’anticorps primaire, Anti-Human IgE (209-002-241), a été dilué en série dans du PBS/T à 1:3 sur toute la plaque et incubé pendant 2 h à température ambiante. L’anticorps secondaire, l’IgG de chèvre anti-souris AffiniPure Peroxidase, Fcγ fragment spécifique (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot) (115-035-071), dilué au 1:20 000 dans du PBS/T, a été incubé sur la plaque pendant 1,5 heure. Le TMB a été appliqué et lu à 620 nm après 30 min.	Figure 4 : Détection d’IgE humaines provenant de différentes sources par ELISA indirect. Plaque revêtue de 100 μl/puit d’IgE humaine purifiée provenant des sources indiquées à 2 μg/ml dans un tampon de revêtement de carbonate pendant une nuit à 4°C. La plaque a été bloquée avec 300 μl/puit de 1 % d’albumine de sérum bovin (BSA) (001-000-161) dans du PBS/T pendant 2 h à température ambiante. L’anticorps primaire, Anti-Human IgE (209-002-241), a été dilué en série dans du PBS/T à 1:3 sur toute la plaque et incubé pendant 1 h à température ambiante. L’anticorps secondaire, l’IgG de chèvre anti-souris AffiniPure Peroxidase, Fcγ fragment spécifique (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot) (115-035-071), dilué au 1:20 000 a été incubé sur la plaque pendant 1,5 heure. Le TMB a été appliqué et lu à 620 nm après 30 min.

Détection d’IgE dans le plasma

Les anticorps anti-IgE humaines de Jackson ImmunoResearch offrent une excellente sensibilité lorsqu’ils sont utilisés dans un test ELISA type sandwich avec son anticorps partenaire de capture. Nous recommandons d’utiliser deux anticorps monoclonaux différents pour la capture et la détection. Dans ce format, utilisez une IgE anti-humaine non conjuguée comme anticorps de capture avant de bloquer avec de l’albumine de sérum bovin (sans IgG, sans protéase 001-000-161). Après lavage, incubez avec votre échantillon dilué. Pour l’étape de détection, utilisez un anticorps anti-IgE humaine conjugué, tel que l’anticorps anti-IgE humaine à la phosphatase alcaline (209-052-241) ou l’anticorps anti-IgE humaine à la peroxydase (209-032-241), suivi du substrat ou de la technique de visualisation appropriée. La figure 5 illustre l’application du test sandwich pour valider la quantification des IgE totales à partir d’échantillons de patients en utilisant des Anti-Human IgE non conjugués en association avec un anticorps de détection conjugué à la phosphatase alcaline. Les IgE totales (kUI/l) des échantillons de patients utilisés dans cette expérience ont été précédemment mesurés par le dosage des IgE totales de Roche Cobas. Ces résultats sont affichés sur l’axe des X de la figure 5.

IgE totales dans les échantillons de patients

Figure 5 : Détection des IgE totales à partir d’échantillons de sérum et de plasma humains par ELISA type sandwich. La plaque a été recouverte d’un anticorps anti-IgE humaine non conjugué (clone 10A10) à 100 μl/puit à 2 μg/ml dans un tampon de coating pendant une nuit à 4°C. La plaque a été bloquée avec 300 μl/puit de 1 % de BSA (001-000-161) dans une solution saline tamponnée au phosphate, 0,05 % de Tween® (PBS/T) pendant 1,5 heure. Incuber avec 100 μl/puit d’échantillons de plasma/sérum dilués au 1:80 dans du PBS/T pendant 1 heure. L’anticorps de détection, Jackson ImmunoResearch Alkaline Phosphatase Anti-Human IgE (209-055-241), a été dilué à 1:10 000 dans du PBS/T et incubé à 100 μl/puit pendant 1 heure. 100 μl/puit de substrat DEA fraîchement préparés, ont été incubés sur la plaque pendant 30 min et lus à 405 nm.

Facteurs de dilution suggérés

Les facteurs de dilution suggérés dans le tableau suivant sont présentés comme des fourchettes car la dilution optimale est fonction de nombreux facteurs, tels que la densité de l’antigène, la perméabilité, etc. La dilution optimale de travail doit être déterminée empiriquement pour chaque.

Tableau de dilution

* Veuillez noter que cet anticorps donnera un signal plus faible lors de la détection de la protéine réduite et n’est donc pas recommandé pour les applications où la détection de l’IgE réduite est requise par western blot.

Références des produits

Références

Cox, L., Larenas-Linnemann, D., Lockey, R. et Passalacqua, G., 2010. Parler la même langue : Le système de classification des réactions systémiques de l’Organisation mondiale des allergies pour l’immunothérapie sous-cutanée. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 125(3), pp.569-574.e7.
Pawankar, R., Canonica, G., Holgate, S., et Lockey, R., 2011. Livre blanc de l’Organisation mondiale de l’allergie (OMA) sur l’allergie. Royaume-Uni : WAO.
Sánchez-Borges, M., Ansotegui, I. & Cox, L. Système de classification de l’Organisation mondiale des allergies pour les réactions allergiques systémiques : il est temps de parler le même langage quand il s’agit de réactions allergiques. Curr Treat Options Allergy 6, 388-395 (2019). https://doi.org/10.1007/s40521-019-00229-8